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      献给初学者:「考马斯亮蓝法」蛋白质浓度测定

      发布日期:2016-10-17 12:44:09

      蛋白质浓度测定的方法有很多,考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作简便,本文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。



      实验原理 


      考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。目前,这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。


      考马斯亮蓝 G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置,由 465 nm 变为 595 nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。



      此法的突出优点


      (1)灵敏度高,据估计比 Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。


      (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要 2 分钟即可完成,其颜色可以在 1 小时内保持稳定,且在 5 分钟至 20 分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。


      (3)干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。



      此法的缺点


      (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。


      (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。



      试剂与器材


      1

      试剂
       


      考马斯亮蓝试剂:


      考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中,加入 100 mL 85% 磷酸,用蒸馏水稀释至 1000 mL。


      2
      标准和待测蛋白质溶液


      (1)标准蛋白质溶液


      结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。


      (2)待测蛋白质溶液。


      人血清,使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。


      3
      器材


      试管 1.5×15 cm(×6),试管架,移液管管 0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。



      操作方法


      制作标准曲线
       


      取 7 支试管,按下表平行操作。




      摇匀,1 h 内以 0 号管为空白对照,在 595 nm 处比色。

       

      绘制标准曲线:以 A595 nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。


      未知样品蛋白质浓度测定


      测定方法同上,取合适的未知样品体积,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。



      注意事项


      (1)在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。


      (2)测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。


      (3)利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。


      怎么样?学会了吗?如果对你有帮助,请狠狠点赞。



      文章来源:丁香园

      图片来源:网络


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