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      献给初学者:关于流式细胞术,这些你要知道

      发布日期:2017年11月21日 16:00   来源:66科技网

      流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球、细菌、小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。作为应用流式细胞术进行检测的技术平台,现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经过近四十年的发展和完善,今天的流式细胞仪已经十分成熟,并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域,在各学科中发挥着重要的作用。


      概述


      一种在液流系统中,快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质,并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA 含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开,以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。目前最高分选速度已达到每秒钟三万个细胞。


      现代流式细胞术综合了流体力学技术、激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术及单克隆抗体技术,是多学科多领域技术进步的结晶。随着现代科技的高速发展,为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求,流式细胞技术仍然在快速发展,并已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。


      简史


      1934 年 A.莫尔达万首次报道了使悬浮的红细胞通过放置在显微镜载物台上的玻璃毛细管的细胞自动计数方法。1956 年 W.H.库尔特介绍一种利用细胞在导电溶液中, 通过两个小室间小孔(75~100 微米)时的电阻变化(称为库尔特电阻)进行细胞计数和测定细胞体积的装置。1965 年 L.A.卡门茨基制成了多参数流式细胞计,可测定细胞大小和核酸含量。同年,M.J.富尔怀勒又制成细胞分选器。1969 年范迪拉等应用氩离子激光器和分层壳流技术,建立了一台液流、照明光轴和检测器轴互相正交的流式细胞计。


      以后,经 H.R.休利特等改进了的细胞分选计,能使流动液体内的细胞喷射到空气中进行测量。但上述各系统中,所使用的激光光束以及设在收集荧光的检测方向上的限制光栏都比液流中的细胞大,因而不能提供关于细胞形态学方面的信息,故称为零分辨率系统。随后,L.L.惠利斯和 S.F.帕滕发展了一种低分辨率的狭缝扫描技术,可以测定细胞核荧光、细胞和细胞核的大小。1969 年,W.格德和 W.迪特里希描述了使用汞灯做光源的流式细胞光度计,在落射光照明下,可激发在流动室中与光轴平行流动的细胞。


      原理


      待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液,在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室,排成单列的细胞,由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流,并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光,由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光;二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管,用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。


      整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓(等高)图来表示。


      对细胞进行分选的原理是,由超声振荡器产生高频振荡,使流动室发生振动,把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴,有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前,光学系统已测定了它们的信号(代表细胞的性质),如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合,或者说,如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时,仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后,其中被选定细胞的液滴就带有电荷,而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转,从而达到了分类收集细胞的目的。


      应用


      细胞生物学研究


      流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的 DNA 含量,得出 DNA 含量分布曲线。例如,在测定 Hela 细胞 DNA 含量分布曲线上,第一个峰是含有 2CDNA 含量的 G1/G0(DNA 合成前期/静止期)细胞, 其次一个峰是 4CDNA 含量的 G2+M(DNA 合成后期+有丝分裂期) 细胞,从 2C~4C 间的区域为 S 期(DNA 合成期)细胞。采用绘图法或计算机拟合法可计算出细胞周期各时相细胞占整个细胞群体的百分数。


      用流式细胞术可进行多参数分析,即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光,或多种不同颜色的荧光。例如细胞经吖啶橙染色后,DNA 发绿色荧光,RNA 发红色荧光。测定这两种荧光就能同时得知一个细胞内的 DNA 和 RNA 含量。测定结果可用二维散点图或三维立体图表示。用这种方法可根据 DNA 和 RNA 含量而鉴别出 G0 与 G1、M 期和 G2 期细胞。用流式细胞术与液体闪烁技术相配合, 还可求得细胞通过 G1、S 和 G2+M 期的时间 (T、Ts、T+M) 及其变异系数。


      近年利用抗溴脱氧尿苷(Brdurd)单克隆抗体能发现渗入到细胞 DNA 内的溴脱氧尿苷。将此种荧光抗体技术与测定细胞 DNA 含量相结合,是研究 DNA 合成和细胞周期的一种非常有用的技术。此外, 流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期,鉴别死细胞和活细胞,利用荧光标记配体,还可定量测定细胞表面和内部的受体等。


      遗传学研究


      用流式细胞术测定染色体 DNA 含量, 可得到染色体频率分布图(图 2),称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰,峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型,而且能分选出不同类型的染色体, 做成人类每条染色体的 DNA 文库,可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。


      免疫学研究


      结合免疫荧光方法,流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞,例如用荧光素标记的免疫球蛋白鉴别 T 和 B 淋巴细胞(图 3),根据细胞表面抗原的不同, 进一步分辨出不同的 T 和 B 淋巴细胞亚群,以及测定每个细胞所带抗原的数量、密度及其动力学参数等。也可用流式细胞分选技术将带有「+」和不带有「-」的某种特异抗原的细胞群体分类收集,供研究其功能特性。


      流式细胞术对于判断免疫缺陷症,如爱滋病(获得性免疫缺损综合征)的重要特征,即 T4 和 T8 淋巴细胞比例改变(T4 细胞大量减少)以及判断自身免疫病和确定白血病、淋巴癌的表型等,都是非常有用的。此外,流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素,测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度,结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目,以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。


      肿瘤学研究


      肿瘤细胞一般都含有异常数量的 DNA。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞,由于流式细胞术样品制备方法简单,测定结果精确,能快速得到有关 DNA 倍性的信息, 因而能提供有价值的诊断数据。如果在测量 DNA 含量的同时,再测定其他参数(如不同类型的中等纤维蛋白,蛋白质含量、细胞大小、核质比等)则可进一步提高诊断的可靠性。


      流式细胞术可在实验和临床中评价肿瘤化疗和放疗的作用,现在根据流式细胞术和细胞动力学数据来监视肿瘤治疗的工作已经在实际工作中开展起来。


      此外,流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展。



      文章来源:丁香园

      图片来源:网络


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